疫苗被認(rèn)為是針對(duì)傳染病的最有效的全球衛(wèi)生干預(yù)措施之一,當(dāng)下和未來(lái)的疫苗研發(fā)都面臨著更加有效和多樣化的保護(hù)反應(yīng)以及越來(lái)越嚴(yán)格的安全系數(shù)的挑戰(zhàn)。開(kāi)發(fā)新疫苗方法和制劑的主要挑戰(zhàn)是增加有效的免疫激活,導(dǎo)致保護(hù)性應(yīng)答,同時(shí)限制過(guò)度的炎癥。為了增強(qiáng)免疫反應(yīng),研究人員已經(jīng)研究了Toll樣受體激動(dòng)劑作為疫苗佐劑,因?yàn)樗鼈兛梢约せ钕忍烀庖呦到y(tǒng),促進(jìn)多種免疫基因的表達(dá),包括對(duì)T細(xì)胞重要的炎性細(xì)胞因子和細(xì)胞表面受體。有效的TLR激動(dòng)劑可刺激所需的細(xì)胞或體液適應(yīng)性反應(yīng),并已成功開(kāi)發(fā)出幾種疫苗,然而無(wú)法直接調(diào)節(jié)炎癥增加了疫苗成本并延緩了其應(yīng)用。現(xiàn)在有多種成功的TLR激動(dòng)劑可用于疫苗,但是新的和高劑量的TLR激動(dòng)劑面臨的挑戰(zhàn)之一是過(guò)度活化或全身分布引起的過(guò)度炎癥。
改善佐劑反應(yīng)是開(kāi)發(fā)針對(duì)某些病原體疫苗的最有希望的途徑,佐劑開(kāi)發(fā)中的一項(xiàng)最大的挑戰(zhàn)就是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),同時(shí)保持免疫激活和保護(hù)作用。目前尚無(wú)批準(zhǔn)具有獨(dú)立調(diào)節(jié)炎癥和保護(hù)作用能力的佐劑。在這里,研究人員展示了一種增強(qiáng)保護(hù)反應(yīng)同時(shí)限制炎癥的方法。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo),研究人員將部分選擇性核因子κB(NF-kB)抑制劑與幾種目前的佐劑聯(lián)合使用,所得疫苗可減輕全身性炎癥并增強(qiáng)保護(hù)性反應(yīng)。研究人員證明了這種方法可以增強(qiáng)保護(hù),并且該方法已在多種佐劑和抗原中進(jìn)行了測(cè)試,不僅可以減少炎癥,還可以增強(qiáng)對(duì)流感、HIV等病毒的保護(hù)性反應(yīng),最終也可以用于開(kāi)發(fā)新冠疫苗,該項(xiàng)研究成果近日發(fā)表在《Science Advances》上。
檢查CpG誘導(dǎo)的炎癥和產(chǎn)生的免疫反應(yīng)
研究人員試圖驗(yàn)證SN50可以使抗原呈遞細(xì)胞上調(diào)細(xì)胞表面受體,同時(shí)限制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。將小鼠骨髓的來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞與SN50和CpG或CpG單獨(dú)孵育了6小時(shí),并分析了增效劑如何改變細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞表面受體的表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色顯示,用SN50處理的細(xì)胞表現(xiàn)出表達(dá)TNF-α和IL-6的細(xì)胞明顯減少。同時(shí),CD86表達(dá)顯著增加并且CD40表達(dá)持續(xù)。因?yàn)閜65-p50二聚體是在靜息細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的最豐富的二聚體,并且參與炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生,所以推測(cè)通過(guò)抑制該二聚體可以在限制炎癥細(xì)胞因子的同時(shí)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞表面受體的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
用模型抗原OVA和免疫佐劑SN50進(jìn)行的體內(nèi)疫苗接種(來(lái)源:Science Advances)
在觀察到SN50可以限制炎癥而不降低體外細(xì)胞表面受體的表達(dá)后,研究人員接下來(lái)想在體內(nèi)研究這種作用。為了確定對(duì)NF-κB的抑制是否可以降低與CpG疫苗接種相關(guān)的促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的全身水平。在人體中,全身性TNF-α與局部副作用(例如注射部位腫脹和疼痛)相關(guān),全身性IL-6與疫苗接種后的全身系統(tǒng)副作用(例如疲勞和頭痛)相關(guān)。此外,這兩種細(xì)胞因子在全身分布時(shí)均充當(dāng)熱原,會(huì)導(dǎo)致發(fā)燒反應(yīng)。研究人員在所有組中注射后1、3、6、24和48小時(shí)測(cè)量了這些促炎細(xì)胞因子,以確定響應(yīng)CpG疫苗接種時(shí)細(xì)胞因子達(dá)到峰值的時(shí)間點(diǎn)。為了確定SN50如何影響體液反應(yīng)研究人員在第28天分析了血清抗體水平,為了廣泛確定SN50的添加如何影響抗體水平使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定來(lái)測(cè)量總Ig(G + A + M)。與單獨(dú)的PBS相比,CpG組的抗OVA抗體增加了2.4倍。接種了CpG + SN50的小鼠比PBS組增加了5.9倍,而CpG組增加了2.7倍。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了添加SN50會(huì)增強(qiáng)下游的適應(yīng)性反應(yīng),從而導(dǎo)致免疫增強(qiáng)。由于疫苗接種后適應(yīng)性反應(yīng)的增加和耐受性的改善,研究人員將SN50歸類為免疫增強(qiáng)劑。
體內(nèi)流感激發(fā)模型的免疫增強(qiáng)
接下來(lái)研究人員將重點(diǎn)關(guān)注SN50如何過(guò)渡到具有病毒挑戰(zhàn)的疫苗。研究人員選擇流感疫苗作為概念驗(yàn)證疫苗,是因?yàn)樗哂型ㄓ眯裕⑶蚁鄬?duì)容易操作。研究人員試圖確定SN50是否會(huì)減少與強(qiáng)佐劑相關(guān)的副作用,并觀察這種改變對(duì)全身細(xì)胞因子的保護(hù)作用。研究人員在2017/2018流感季節(jié)使用Fluzone四價(jià)疫苗注射給小鼠,有無(wú)CpG(50μg)作為免疫佐劑,有500μgSN50(SN50H或50μgSN50(SN50 L)作為免疫佐劑免疫增強(qiáng)劑。Fz + SN50組的TNF-α水平低于單獨(dú)Fz。在所有組中,添加SN50可使TNF-α和IL-6的水平降低至與安慰劑組一致的水平。為了檢查SN50是否可以減輕接種疫苗的副作用,研究人員分析了接種后24、48和72小時(shí)的體重變化百分比。體重減輕是小鼠副作用最客觀的度量,到24小時(shí)時(shí),接種Fz和Fz + SN50的小鼠平均損失0.85和0.75%,F(xiàn)z + CpG組平均損失5.9%。在第72小時(shí),F(xiàn)z組的體重為起始體重的-1.1%,而接種Fz + SN50的小鼠體重增加了+ 1.5%。Fz + CpG組的體重減輕了起始重量的-1.6%,添加SN50 H導(dǎo)致體重減輕(變化0%),添加SN50 L導(dǎo)致體重減輕了-1.3%。總體而言,具有SN50的小鼠比沒(méi)有SN50的小鼠體重減輕得更少,這表明SN50降低了與疫苗接種相關(guān)的副作用,并提高了疫苗的耐受性。
流感挑戰(zhàn)模型(來(lái)源:Science Advances)
在第28天,研究人員分析了血清中血液中的抗體水平,F(xiàn)z和Fz+ SN50之間的血清IgG濃度無(wú)顯著差異,F(xiàn)z樣品和Fz+CpG之間有2.9倍的顯著差異。接種CpG的組之間無(wú)顯著差異,這表明添加SN50可以減輕炎癥和疫苗接種的副作用,提高耐受性,同時(shí)保持抗體濃度。接下來(lái),研究人員試圖確定在疫苗中加入SN50是否會(huì)增強(qiáng)對(duì)Fluzone的保護(hù)。在此階段沒(méi)有對(duì)小鼠施用任何額外的SN50,因此只有疫苗誘導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)和隨后的加強(qiáng)免疫可以起到保護(hù)小鼠免受流感的作用。在Fz+CpG中添加SN50可提供同等的保護(hù),同時(shí)可改善初次接種疫苗的副作用和耐受性,在Fz中添加SN50可提供等同于Fz+CpG組的增強(qiáng)保護(hù)。這表明SN50除了提高耐受性外,還可以增強(qiáng)疫苗的適應(yīng)性免疫潛能。
新疫苗佐劑的耐受性和保護(hù)性通常被認(rèn)為是兩個(gè)具有反比關(guān)系的相互依賴的變量,其中通過(guò)限制耐受性獲得了足夠的保護(hù),反之亦然。由于這種增強(qiáng)劑使疫苗既安全又更具保護(hù)性,研究人員想要尋求一種單一方法來(lái)分析SN50如何改變耐受性和保護(hù)性。由于這些變量被認(rèn)為是負(fù)相關(guān)的,因此很少有相關(guān)的先例。遵循評(píng)分系統(tǒng)的先例,研究人員開(kāi)發(fā)了一個(gè)容忍度與保護(hù)度的關(guān)系圖,該圖僅用作本研究中收集的所有數(shù)據(jù)的直觀表示。在疫苗接種中包括SN50的所有組均增加了耐受性和疫苗保護(hù)性。綜合所有數(shù)據(jù)后得出結(jié)論,SN50通過(guò)增加耐受性和改善疫苗接種的保護(hù)效果而充當(dāng)免疫增強(qiáng)劑。
改善各種TLR和物種的佐劑反應(yīng)
為了檢查SN50在各種TLR激動(dòng)劑中的作用,研究人員對(duì)用SN50處理的RAW巨噬細(xì)胞進(jìn)行了定量聚合酶鏈反應(yīng),然后用不同TLR的激動(dòng)劑進(jìn)行刺激。用SN50和脂多糖(LPS;10ng/ml)、CpG(5μg/ ml)、R848(1μg/ml)和Pam3CSK4(100ng/ml)刺激細(xì)胞,并將轉(zhuǎn)錄水平與TLR激動(dòng)劑處理的細(xì)胞進(jìn)行比較單獨(dú)使用。在RAW巨噬細(xì)胞中,研究人員觀察到TNF-α和IL-6的下調(diào)促炎細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平。與單獨(dú)的激動(dòng)劑相比,在所有激動(dòng)劑中細(xì)胞表面受體CD86和MHCII轉(zhuǎn)錄水平均被上調(diào)。這與體內(nèi)觀察結(jié)果相吻合,當(dāng)在SN50與CpG一起使用時(shí),淋巴結(jié)內(nèi)cd86表達(dá)增加并且細(xì)胞活性增加,這表明增加T細(xì)胞反應(yīng)和增加與T細(xì)胞中細(xì)胞遷移和細(xì)胞毒性相關(guān)的基因表達(dá)的相同作用對(duì)于大多數(shù)佐劑將維持不變。
多種佐劑的體內(nèi)疫苗接種(來(lái)源:Science Advances)
為了檢查其在體內(nèi)的翻譯方式,研究人員使用gp120作為抗原為小鼠接種了CpG(50μg)、Pam3CSK4(20μg)和R848(50μg),將這些佐劑與最廣泛使用的明礬(250μg)一起使用。使用CpG觀察到完全消除了全身性TNF-α和IL-6促炎細(xì)胞因子,使用R848和Pam3CSK4發(fā)現(xiàn)TNF-α和IL-6均顯著降低。僅明礬不會(huì)引起全身性細(xì)胞因子應(yīng)答,并且添加SN50不會(huì)改變細(xì)胞因子譜。這些數(shù)據(jù)表明,SN50在廣泛的佐劑上可用于減輕全身性炎癥,同時(shí)維持提高適應(yīng)性反應(yīng),這證明了該系統(tǒng)對(duì)大量免疫佐劑具有廣泛的潛在用途。
為了了解這種效果如何轉(zhuǎn)化為人類疫苗,研究人員用含或不含SN50的LPS(1μg/ ml)處理了THP-1單核細(xì)胞。用SN50和LPS處理的細(xì)胞表達(dá)的TNF-α和IL-6水平明顯降低,還觀察到CD40和CD86的水平增加。用SN50和LPS或單獨(dú)的LPS刺激了NHP PBMC 6小時(shí),并分析了細(xì)胞上清液中的促炎細(xì)胞因子,用LPS刺激的細(xì)胞在細(xì)胞上清液中顯示出高水平的TNF-α和IL-6,而具有SN50的細(xì)胞則顯示出細(xì)胞因子水平的顯著降低。因此與單獨(dú)用LPS刺激的細(xì)胞相比,用SN50和LPS刺激的細(xì)胞中CD86表達(dá)增加了兩倍,這意味著SN50在NHP和人類中的作用可能與在小鼠中的相似。